1. Tách huyết tương giàu tiểu cầu:
Hãy nhớ trong xét nghiệm này cần huyết tương giàu tiểu cầu vì cơ chế đông giống như Howell, do vậy nếu bạn lấy huyết tương nghèo tiểu cầu thì phần sau huyết tương này sẽ không đông được khi chỉ cho Ca++ do thiếu sự tham gia cầu tiểu cầu. Mặt khác nếu bạn tách huyết tương nghèo tiểu cầu có nghĩa là bạn phải ly tâm vòng cao và như vậy phần lớn fibrinogen bị lắng xuống làm cho nồng độ fibrinogen trong huyết tương giảm đi và cũng không hình thành được fibrin. Cách làm như sau:
Lấy máu tĩnh mạch chống đông bằng Natri citrat 3,8% với tỷ lệ 1/10. Để tự lắng tự nhiên hoặc ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút trong 5 phút, tách huyết tương.
2. Pha loãng và acid hóa huyết tương:
Cho vào ống nghiệm 0,3 ml huyết tương ở trên sau đó thêm 3ml nước cất. Thêm 1-2 giọt acid acetic 2% để có pH 5,2. Khi pha loãng và acid thế này sẽ hình thành tủa fibrinogen cùng các chất hoạt hóa quá trình tiêu sợ huyết (t-PA-plasminogen) các chất ức chế gần như được loại bỏ trong tủa này. Lưu ý là pH phải điều về 5,2 bằng acid nhẹ. Nếu bạn dùng các acd mạnh và pH dưới 5,2 có thể làm biến tính fibrinogen. Ngược lại nếu pH > 5,2 thì sẽ không tạo được tủa hoặc không loai bỏ được các chất ức chế trong tủa.
3. Ly tâm và tách tủa.
Ở bước này bạn sẽ ly tâm với tốc độ vòng rất cao (khoảng 3000v/phút x 15') để tạo tủa hoàn toàn. Sau đó đổ phần dịch trong. Hãy nhớ là đổ dịch trong chứ không hút bằng cách dốc thẳng ống nghiệm sau ly tâm để đổ dịch trong bên trên đi. Nếu bạn hút có thể làm sục tủa này lên.
4. Thấm khô ống nghiệm.
Bạn dùng giấy thấm để thấm thật khô thành ống nghiệm để loại bỏ hoàn toàn dịch trong. Nếu bạn làm không khô thì có thể sẽ còn sót lại các chất ức chế quá trình tiêu sợi huyết. Và như vậy khi tủa này được làm đông thì quá trình tiêu cục đông có thể kéo dài do còn chất ức chế
5. Làm tan tủa.
Thêm vào 0,3 ml dung dịch đệm Michaelis pH 7,35 đã pha loãng 1 /4 trong dung dịch NaCl 0,9 %, dùng que đánh tan tủa. Lưu ý đệm này phải pha loãng 1 phần đệm và 3 phần nước muối sinh lý. Nếu chỉ dùng đệm không thì plasminogen không hoạt động được ngược lại nếu không có đệm pH trung tính thì plasmin lại không hoạt động. Và tỉ lệ 1/4 là tối ưu để cả plasminogen và plasmin hoạt động tốt nhất.
6. Làm đông trở lại và xác định thời gian tan đông.
Cho thêm vào ống 1 giọt CaCl2 M/10, đặt ống nghiệm vào bình cách thuỷ 370 C, chờ đông. Bấm đồng hồ theo dõi thời gian từ khi đông tới khi tan hoàn toàn. Lúc này cơ chế đông sẽ giống như đông máu trong xét nghiệm Howell. Bạn có thể dùng CaC2l M/40 nhưng phải dùng lượng nhiều hơn, như vậy sẽ bị pha loãng và có thể sẽ không đông hoàn toàn hoặc thời gian đông hoàn toàn lâu hơn. Ở đây ta chỉ cần tính thời gian từ khi đông hoàn toàn đến khi tan đông hoàn toàn nên cần rút ngắn thời gian chờ đông.
Tuy nhiên trong một số trường hợp cục đông không thể hình thành do 4 lý do chính sau:
- Thiếu hoặc không có tiểu cầu: Cần ly tâm tốc độ vòng thấp để thu đươc huyết tương giàu tiểu cầu.
- Lượng fibrinogen quá ít: Có thể thêm 1 lượng fibrinogen vào huyết tương.
- Hệ thống hoạt hóa plasminogen quá mịnh dẫn đến đông đến đâu tan ngay đến đó làm ta không thấy được cục đông: Xử lý bằng cách thêm huyết tương bình thường vào trước khi cho CaCl2, khi đó cục đông hình thành và tan rất nhanh.
- Tiêu thụ hết các yếu tố của hệ thống đông máu như trong bệnh lý đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC): Xử lý bằng cách cũng thêm huyết tương bình thường vào, khi đó cục đông hình thành nhưng sau 60 phút vẫn không tan được do đã hết các yếu tố hoạt hóa quá trình tiêu fibrin.
Trên đây là 6 kinh nghiệm cần lưu ý của mình để có thể làm thành công được nghiệm pháp Von-Kaulla. Mình đã làm như vậy và chưa lần nào thất bại. Vậy các bạn hãy thử làm và lưu tâm những điểm mình trình bày ở trên xem sao? Nếu có gì bất thường hoặc có thêm kinh nghiệm gì chia sẻ thêm vui lòng phản hồi tại đây cùng mình.